細胞色素b-245β肽酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū) 實(shí)驗原理: 本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中血清素/血清胺(ST)水平。用純化的血清素/血清胺(ST)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入血清素/血清胺(ST),再與HRP標記的血清素/血清胺(ST)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經(jīng)過(guò)徹di洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶S的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血清素/血清胺(ST)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度(OD值),通過(guò)標準曲線(xiàn)計算樣品中血清素/血清胺(ST)濃度。 標本要求: 1.標本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻進(jìn)行,提取后應盡快進(jìn)行實(shí)驗。若不能馬上進(jìn)行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融 2.不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的(HRP)活性。 樣本處理及要求: 1.血清:全血標本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將標本放于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。 2. 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內于2 - 8°C 1000g離心20分鐘,或將標本放于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。 3. 組織勻漿:用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會(huì )影響測量結果),稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,具體體積可根據實(shí)驗需要適當調整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復凍融。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。 4. 細胞培養物上清或其它生物標本:1000g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將標本放于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。 試劑盒組成 : 1、30倍濃縮洗滌液 20ml×1瓶 7 終止液 6ml×1瓶 2、酶標試劑 6ml×1瓶 8 標準品(160pg/ml) 0.5ml×1瓶 3、酶標包被板 12孔×8條 9 標準品稀釋液 1.5ml×1瓶 4、樣品稀釋液 6ml×1瓶 10 說(shuō)明書(shū) 1份 5、顯色劑A液 6ml×1瓶 11 封板膜 2張 6、顯色劑B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1個(gè) 試劑盒特點(diǎn): 1、高效、靈敏、特異的抗體; 2、穩定的重復性和可靠性; 3、吸附性能好,空白值低,孔底透明度高的固相載體; 4、適用血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養上清液、尿液等等多種標本類(lèi)型; 5、節省實(shí)驗經(jīng)費。 操作步驟: 1. 標準品的稀釋?zhuān)罕驹噭┖刑峁┰稑藴势芬恢?,用?hù)可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。 80pg/ml | 5號標準品 | 150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液 | 40pg/ml | 4號標準品 | 150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液 | 20pg/ml | 3號標準品 | 150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液 | 10pg/ml | 2號標準品 | 150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液 | 5pg/ml | 1號標準品 | 150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。 3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。 4. 配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用 5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿(mǎn)洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。 6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。 7. 溫育:操作同3。 8. 洗滌:操作同5。 9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色10分鐘. 10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時(shí)藍色立轉黃色)。 11. 測定:以空白孔調零,450nm波長(cháng)依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15分鐘以?xún)冗M(jìn)行。 操作程序總結:
計算: 以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線(xiàn),根據樣品的OD值由標準曲線(xiàn)查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品的實(shí)際濃度。 注意事項: 1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開(kāi)封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。 2.濃洗滌液可能會(huì )有結晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結果。 3.各步加樣均應使用加樣器,并經(jīng)常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。 4. 請每次測定的同時(shí)做標準曲線(xiàn),最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過(guò)高(樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再測定,計算時(shí)請最后乘以總稀釋倍數(×n×5)。 5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。 6.底物請避光保存。 7.嚴格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準. 8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。 9.本試劑不同批號組分不得混用。
|